基因克隆与基因工程育种

点击数:7892015-11-03 10:23:11

应用基因定位克隆、转座子和转基因标签法以及mRNA差显技术结合作物基因组序列图谱,从水稻、小麦和玉米及近缘属物种中克隆水稻寡分蘖、抗纹枯病、千粒重,小麦谷蛋白和玉米抗纹枯病、穗粒腐病、耐旱等新基因。将新基因的完整序列与NCBI和Gen-Bank等核酸蛋白数据库中的同类基因序列进行比较,确定新基因的知识产权,解析功能特性。利用蛋白质表达载体进行新基因的体外表达,验证新基因的功能。通过快速、准确、高效、无抗生素选择标记的转基因技术体系和外缘基因高效表达元件的研究,构建具有自主知识产权的新基因高效真核表达载体,选用高产品种为主要受体材料,利用已建立的转基因技术体系对上述基因进行遗传转化,转基因再生植株通过田间鉴定,组织化学检测,PCR扩增,Southern-blot,后代遗传、性状表现分析等方法,评价转基因新材料的育种价值,筛选可供利用的优异新材料,应用于新品种选育研究。到建设期末,克隆具有自主知识产权的新基因4~6个,获得转基因新材料或新品系8~10份。在国内外重要学术刊物发表论文10~12篇,达到国内先进水平。

水稻基因克隆:(1)采用定位克隆方式克隆了抗稻瘟病新基因Pi-d2和Pi-d3,早熟显性基因、无花粉型隐性核不育基因ms-np、寡分蘖基因ft1-g和千粒重相关基因Mi3也已获得候选基因,目前正在进行互补试验验证其功能。(2)利用T-DNA插入突变体,克隆了生育期和千粒重相关基因osELF3。(3)运用同源克隆结合酵母双杂交方法,发现了8个与HSP-90家族互作的新基因;构建了DREB2A-LIKE基因的酵母单/双杂交系,正在初步验证基因的功能;初步分析了一个高温与低温双诱导表达的基因(HL82)的结构。(4)通过分子杂交和RT-PCR验证,发现了204个低温/干旱反应敏感基因,并分离获得了1个反应敏感基因的启动子。(5)针对水稻抗虫问题,通过对原生态有益微生物的筛选和基因组分析,克隆获得新型杀虫基因25个,具有知识产权的新型模式杀虫基因14个,获得系列杀虫新基因包括cry1Ac20 DQ285666、cry1Ac25 FJ513324、cry2Aa12 DQ977646、cry2Ab12 ABM21764、cry2Ab13 EU909454、cry9Ea4 EU760456、cry9Ea5 EU789519、cry30Ea2 FJ499389、cyt2A3 EU835185、cry1Ia-like等,占我国模式杀虫基因数量的1/2以上(我国具自主知识产权的cry模式基因共有26个,占世界14.8%),其中具有广谱抗虫功能的Bt杀虫基因1个,正式命名为CryIAC20。(6)克隆了对真菌性病毒具有防止作用的几丁质酶基因1个。

水稻基因工程育种:(1)以上述已克隆的抗稻瘟病基因Pi-d2和Pi-d3、抗虫基因CryIAC20和引进的抗白叶枯病基因Xa-21、抗虫基因SCK、GNA、Bt,耐热基因TT1、抗旱基因HDG11、抗盐基因COM和BADH、抗衰老基因PPF、品质相关基因(反义Wx基因、SB401)为基础,构建了系列无选择标记的表达载体。(2)以籼型杂交水稻骨干亲本为基础,通过培养基成分和培养条件的筛选,获得了系列具有较高转化效率的受体亲本,如D62B、蜀恢527和D香B等。(3)目前在国家转基因项目的支持下,已建立了规模化转基因技术平台,获得了大批转基因植株,其中抗稻瘟病、白叶枯病和抗虫转基因材料正在申请环境释放。

小麦:基因克隆 (1)从普通小麦及其近缘种属(一粒小麦、野生二粒小麦、阿拉拉特小麦、提莫菲维小麦、节节麦等)中克隆了20个醇溶蛋白基因,并完成其序列分析,已在Genbank登录。(2)从中国特有小麦(新疆稻麦、西藏地方小麦品种)及小麦近缘物种(节节麦、尾状山羊草、带芒草、长穗偃麦草、粘果山羊草、毛节草等)中成功地分离克隆出了15个高分子量谷蛋白新基因,并完成其序列分析,已在Genbank登录。其中,首次对不表达1By亚基的基因克隆工作,发现的分子机制不同于已报道的小麦其它不表达亚基。(3)克隆了来自三个不同黑麦种黑麦2RS染色体臂上的3个75K γ-secalin基因pSec-1、pSec-2和pSec-3。(4)从普通小麦及其近缘种属(带芒草、高大山羊草、野生二粒小麦、节节麦和钩刺山羊草等)中克隆了22个低分子量谷蛋白新基因,完成Genbank收录。(5)从节节麦AS60隆出小麦AP2的同源基因WtAP2,并完成其序列分析。(6)利用高通量cDNA芯片表达技术,从长穗偃麦草7E染色体上初步筛选出70个赤霉病抗性相关基因。

小麦转基因工程育种 (1)筛选出了一批农艺性状优良、再生频率较高的小麦基因型作为转基因的受体材料。(2)对组织培养技术和基因枪法、农杆菌介导法等转基因操作环节进行优化,构建了以成熟胚和幼胚为外植体的小麦植株转基因再生体系,建立了适用于四川小麦受体材料的转基因技术体系。(3)从六倍体普通小麦和二倍体近缘属物种中克隆出高分子量谷蛋白基因的启动子,并利用获得的启动子,构建了胚乳特异性表达来自偃麦草物种的具有自主知识产权的新型高分子量谷蛋白基因Ee1.5的转基因载体,利用该载体采用基因枪法对四川小麦进行遗传转化,已获得86株转化植株。(4)已将一个抗旱基因SAMDC和一个控制细胞分裂基因cycd2导入绵阳11,获得4株转基因小麦植株。

     玉米基因克隆研究:(1)运用电子克隆方法拼接PP2C的cDNA全序列为一个长度为1731 bp的contig,结果表明,P3/P4引物扩增到一条长度约950 bp的条带;P1/P2引物扩增到一条长度约1kb的条带,证明电子拼接序列完全正确。同源性比较表明,该PP2C是PP2C基因家族中的新成员,命名为PIZmPP2C。(2)以高耐玉米纹枯病材料R15,纹枯病菌丝侵入寄主叶鞘的具体时间构建SSH文库时的取样时间,利用SSH方法构建正、反向差减文库,获得51条唯一的EST序列。经生物信息学分析,发现一个于水稻丝氨酸羧肽酶I基因同源的EST与抗性QTL qBLSB-1C具有相同的临近标记umc1245。(3)利用抑制性扣除杂交技术分离18599(红)愈伤组织分化相关基因。分离获得了29个与愈伤组织分化相关的差异表达EST序列,经同源分析,21个功能已知,7个功能未知,1个未发现同源序列,可能为新基因。(4)低磷胁迫相关基因的筛选与鉴定:利用基因芯片分析了低磷处理后玉米根系的基因表达情况,发现683个差异表达基因,其中上调表达的426个,下调表达的257个。这些差异基因涉及了氮素代谢、糖类合成与分解,脂类代谢,呼吸和光和作用,离子运输、电子传递,抗性反应等生命过程。其中酸性磷酸酶、植酸酶、磷转运蛋白等基因直接参与了低磷胁迫下的适应性反应过程;课题组进一步对候选基因进行了Real-Time PCR 验证和酶活性分析。这些研究这些对今后阐明玉米响应低磷胁迫的分子机制具有重要的意义。(5)重要性状表达调控非编码RNA的发掘与功能研究:利用现代分子生物学技术对玉米纹枯病胁迫、低磷胁迫、花粉发育及种子萌发调控过程中的关键调控小分子RNA进行了分离,结合文库构建和生物信息学方法,分离筛选到关键调控miRNA共30多个,目前正在对部分miRNA的表达和功能进行研究。

玉米基因工程育种:(1)从加拿大引进耐旱基因DREB、SOD1和SOD2等3个;从美国引进了耐旱基因海糖藻糖-磷酸合成酶基因。(2)将口踢疫O型和Asia Ⅰ型衣壳蛋白全长基因P1及衣壳蛋白元素免疫后性基因VP1,通过密码子优化等一系列措施,构建玉米高效表达载体,通过基因枪和农杆菌转化的方法,导入优良玉米自交系18-599416251、Zm12等;然后配制双价口踢疫转基因饲草玉米,通过口饲喂达到对口踢疫免疫的效果。(3)构建了小麦来源MnSOD基因的单子叶植物高效表达载体,用基因枪法转化玉米自交系胚性愈伤组织,经潮酶素梯度浓度培养基筛选,从阳性愈伤组织再生获得9株正常结实的转基因植株。